Cytopathologie: Diagnostische DNA-Zytometrie

Indikationen für die Messung der Zellkern-DNA-Gehalte in Zellen und Geweben im Rahmen der Tumordiagnostik sind 1. die Identifizierung obligater Präkanzerosen unter den (vor allem epithelialen) Dysplasien (=Dignitätsdiagnose) und 2. eine objektive und valide Gradierung der malignen Potenz verschiedener Tumoren (=Malignitätsgrading).

 

Biologische Grundlagen der diagnostischen DNA-Zytometrie sind für die meisten Tumoren charakteristische, numerische und/oder strukturelle Chromosomenaberrationen (= chromosomale Aneuploidien). Eine normale Population proliferierender diploider Zellen zeigt in einem DNA-Histogramm einen ersten Häufigkeitsgipfel bei 2c (entsprechend der G0/1-Phase des Zellzyklus) und einen zweiten bei 4c (ent-sprechend der G2/M-Phase). Der Bereich zwischen beiden Gipfeln ist der Synthesephase zugeordnet. Die ersten während der Onkogenese lichtmikroskopisch nachweisbaren Chromosomenaberrationen werden als primäre bezeichnet, z. B. eine Trisomie 7 und 17 bei chromophilzelligen Nierenzellkarzinomen (Abb. 6). Während der Tumorprogression treten dann meist tumorspezifisch weitere sekundäre (Abb. 7 u. 8) und tertiäre Aberrationen (Abb. 9) hinzu, welche mit einer Zunahme der malignen Potenz der Tumoren einhergehen. Die entsprechenden quantitativen Abweichungen der DNA-Verteilung der Zellkerne von der Norm werden zur Diagnostik bzw. Prognostik herangezogen (Abb. 5, 10-13). In einigen Geweben kann es physiologischerweise zu einer Vervielfachung des normalen Chromosomensatzes entsprechend den ganzzahligen Potenzen des normalen 2c-Gehaltes kommen (4c, 8c, 16c). Diese euploide Polyploidisierung kann auch durch HPV-Infekte oder Vitamin-B12-Mangel verursacht werden (Abb. 4). Sind die chromosomalen Aneuploidien ausgeprägt genug, um DNA-zytometrisch als signifikante Normabweichungen identifiziert zu werden (meist < oder > 10 %), so spricht man von DNA-Aneuploidie. Zum Zweck der Malignitätsgradierung wird das Ausmaß der DNA-Aneuploidie tumortypspezifisch quantifiziert (DNA-Malignitätsgrading).

 

Als Untersuchungsgut kommen alle zytologischen Präparate sowie formalinfixiertes und in Paraffin eingebettetes Gewebe nach enzymatischer Zellvereinzelung in Frage. Auch jahrzehntelang archivierte Zell- oder Gewebsproben können verwendet werden. Voraussetzung ist eine stochiometrische, spezifische Anfärbung der Zellkern-DNA mit Thionin (blau) oder Pararosanilin (violett) nach R. Feulgen (1924).

 

Meßtechnik. Die Messung der integrierten optischen Dichte der gefärbten Zellkerne erfolgt interaktiv am Monitor eines TV-Bildanalysesystems, welches mit einem konventionellen Mikroskop gekoppelt ist, bei der Wellenlänge, die dem Extinktionsmaximum des verwendeten Farbstoffs entspricht. Nach interner Kalibrierung mit normalen Zellen (Lymphozyten, Granulozyten, Epithelzellen, Bindegewebszellen) bestimmt der Untersucher per Mausklick ca. 300 Zellen zur Messung (Abb. 1, 2).

 

Die diagnostische Interpretation der DNA-Histogramme zum Zweck der Identifizierung obligater Präkanzerosen bzw. der Frühdiagnose von Krebs (Dignitätsdiagno-stik) beruht auf dem qualitativen Nachweis von DNA-Aneuploidie. Dieser gelingt entweder durch Nachweis einer signifikant abnormen Lage einer Stammlinie (=erstes Häufigkeitsmaximum einer proliferierenden Zellpopulation; < 1,8c > 2,2c, < 3,6c > 4,4c oder durch den Nachweis abnorm hoher Einzelzell-DNA-Werte > 9c). Zum Zweck der Malignitätsgradierung wird das Ausmaß an DNA-Aneuploidie quantifiziert. Da verschiedene Tumoren unterschiedliche sekundäre und tertiäre Chromosomen-aberrationen während der Tumorprogression zeigen können, muß die prognostische Interpretation der DNA-Verteilung im Prinzip tumortypspezifisch erfolgen. Für viele Karzinome (Nieren-, Prostata-, Mamma-, Urothel-) hat sich die Unterscheidung in peridiploide, peritetraploide, aneuploide mit einer Stammlinie und aneuploide Muster mit mehreren Stammlinien als prognostisch relevant erwiesen (Abb. 10-13). Für andere Tumoren (z. B. chronisch-myeloische Leukämie, Riesenzelltumoren des Knochens) sind andere Indizes der DNA-Verteilung prognostisch relevant.

 

Dignitätsdiagnostik: In Gebärmutterhalsabstrichen mit geringen und mittleren Dysplasien (Gruppe IIID) können durch Nachweis von DNA-Aneuploidie diejenigen identifiziert werden, die sich mit 93 %iger Wahrscheinlichkeit unbehandelt in Platten-epithelkarzinome weiterentwickeln werden. Dasselbe gilt für Dysplasien der Mund-, Kehlkopf-, Bronchial-, Ösophagus-, Magen- oder Dickdarmschleimhaut (auch an Gewebsproben). In der zytologischen Diagnostik erlaubt oft erst der Nachweis von DNA-Aneuploidie die Identifizierung von Tumorzellen, da entweder zu wenige Zellen vorliegen oder die malignitätsbeweisenden Atypien zu gering ausgeprägt sind (z. B. in Ergüssen, Urinen, Sputen, Abstrichen der Kornea oder Gallengänge, FNAB des Pankreas).

 

Malignitätsgrading: Bei Prostata- und Harnblasenkarzinomen in frühen Stadien erlaubt das DNA-Malignitätsgrading relevante therapeutische Weichenstellungen: Bei älteren Patienten mit rein diploidem oder tetraploidem Prostatakarzinom kann eine "wait and see"-Haltung eingenommen werden, da die betroffenen Patienten auch ohne Therapie keine verminderte Lebenserwartung haben. Bei diploiden, oberflächlichen Harnblasenkarzinomen kann nach Resektion auf eine adjuvante Therapie verzichtet werden, da die Tumoren ein äußerst geringes Progressionsrisiko aufweisen. Bei Mammakarzinomen im Stadium T1 und N0 kann auf eine adjuvante Therapie ebenfalls verzichtet werden, da diese Tumoren ein äußerst geringes Metastasierungsrisiko aufweisen. Auch bei Dickdarmkarzinomen, chronisch-myeloi-scher Leukämie oder Riesenzelltumoren des Knochens kann das DNA-Malignitäts-grading durch Identifizierung prognostisch besonders günstiger Tumoren helfen, eine Übertherapie zu vermeiden.